آنزیم تگ پلیمراز
بیحرکتی آنزیم به طور گسترده ای مورد بررسی قرار گرفته است تا خصوصیات آنزیمی را در کاربردهای تجزیه و تحلیل و تجزیه آنالیز کند. در اینجا ، ما یک سکوی ساده و همه کاره بیحرکتی آنزیم بر اساس چسبندگی پپتیدها ، یعنی برچسب های مهم را معرفی می کنیم. برچسب های Matter imm آنزیم ها را به روشی گرا به عنوان یک لایه متراکم متلاشی می کنند. سکوی بیحرکتی با سه پپتید ترویج چسبندگی ایجاد شد. Cecropin A (CecA) ، کروماتوگرافی مایع اوج I (LCI) ، و تاکیستاتین A2 (TA2) ، که از نظر ژنتیکی برای تقویت پروتئین فلورسنت سبز سبز و به دو آنزیم مهم صنعتی ذوب شده اند: یک فیتاز (از Yersinia mollaretii) و یک سلولز (CelA2 از یک کتابخانه متاژنومی). در اینجا ، ما یک پلت فرم بیحرکتی مبتنی بر برچسب Matter universal جهانی و ساده را برای آنزیم ها در مواد مختلف از جمله پلیمرها (پلی استایرن ، پلی پروپیلن و پلی اتیلن ترفتالات) ، فلزات (فولاد ضد زنگ و طلا) و مواد مبتنی بر سیلیکون (ویفر سیلیکون) گزارش می دهیم. بیحرکتی آنزیمی مبتنی بر برچسب Matter در دمای محیط طی چند دقیقه (<10 دقیقه) در محلول آبی که با غوطه ور کردن مواد مورد نظر ، فیتاز یا سلولز را مهیا می کند ، انجام می شود. LCI پپتید به عنوان پروموتر چسبندگی جهانی شناخته شد. LCI هر دو آنزیم را بر روی تمام مواد مورد بررسی بی حرکت کرد. پیوستگی فیتاز ‐ LCI روی طلا با طیف سنجی رزونانس پلاسمون سطح به دست آوردن یک مقدار ثابت تفکیک (KD) 2.9 · 10-8 M و حداکثر پوشش سطح 504 نانوگرم بر سانتیمتر مشخص شد.
مقدمه آنزیم تگ پلیمراز
آنزیم ها نقش مهمی در فرآیندهای بیوکاتالیستی ، دستگاه های تحلیلی و زیست پزشکی دارند. در بسیاری از برنامه ها ، آنزیم ها برای مطابقت با شرایط عملکرد باید بی حرکت شوند. بیحرکتی آنزیم ها امکان جداسازی ساده از محصول ، استفاده مکرر ، کاهش یا از بین بردن آلاینده های پروتئینی در محصول و تقویت آنزیم / ثبات فرآیند را فراهم می کند (نگوین و کیم ، 2017 ؛ Scouten ، Luong و Stephen Brown، 1995). روشهای برجسته بیحرکتی شامل پیوند متقاطع آنزیم ها ، اتصال به یک تکیه گاه ، و گرفتار شدن در حامل (Datta، Christena، & Rajaram، 2013؛ Sheldon، Schoevaart، and Van Langen، 2005). اتصال متقاطع آنزیم ها یک روش بی حرکتی بدون حامل است و شامل آنزیم های متقاطع (CLEs) ، کریستال های آنزیم متصل به متقابل (CLECs) و مصالح آنزیمی با اتصال متقاطع است (CLEAs ؛ شلدون و همکاران ، 2005). CLEA ها به دلیل افزودن نمک ، حلالهای آلی قابل پخش در آب یا پلیمرهای غیر یونی با بارش آنزیم ها (در محلول آبی) تهیه می شوند. این سنگدانه ها متعاقباً توسط گلوتارآلدئید یا پلی آلدئید دکستران با گروه های واکنشی در معرض سطح آنزیم های همجوار (به عنوان مثال ، گروه های آمینه آزاد مانده لیزین) در ارتباط هستند. بسته به تعداد موجود لیزینهای در معرض سطح ، این روش بدون حامل می تواند منجر به سنگدانه های حاوی بخش زیادی از آنزیم فعال شود (شلدون ، 2011).
روش های بیحرکتی مبتنی بر حامل به تداخلات بدنی بین آنزیم ها و سطوح مواد وابسته است. به طور خاص ، میل آنزیم به ماده برای بیحرکتی مهم است و با حضور گروههای فعال خاص روی حامل تضمین می شود (Jesionowski ، Zdarta ، & Krajewska، 2014). این ماده با توجه به تعامل حامل آنزیم و آنزیم انتخاب شده است (Jesionowski و همکاران ، 2014). جذب آنزیم روی سطوح یک فرآیند گرا نیست و ممکن است منجر به فعل و انفعالات حامل آنزیم غیر تولیدی شود که در آن دسترسی به سایت فعال مسدود شده یا انعطاف پذیری آنزیم کاهش می یابد. دومی معمولاً برای حفظ فعالیت کاتالیزوری بالا لازم است. علاوه بر این ، تراکم بسته بندی می تواند به چند لایه با محدودیت انتقال جرم منجر شود (Homaei، Sariri، Vianello، & Stevanato، 2013).
پپتیدهای تقویت کننده چسبندگی جایگزین امیدوار کننده ای برای بیحرکتی آنزیم ها هستند زیرا آنها می توانند بی حسی آنزیم ها در دمای محیط از محلول آبی را فعال کنند (Zou، Mate، Rübsam، Jakob، and Schwaneberg، 2018). مثالهای برجسته برای پروموتورهای چسبندگی طبیعی ، ماژولهای اتصال کربوهیدرات (CBM) هستند که در آنزیمهای هیدرولیتیک (به عنوان مثال ، گلیکوزیل هیدرولازها و ترانسفرازهای گلیکوزیل) یافت می شوند. CBM ها چسبندگی به بستر طبیعی خود را تقویت می کنند (به عنوان مثال سلولز ، کیتین ، نشاسته ، گلیکوژن ، اینولین و زایلان) برای بهبود بهره وری هیدرولیز (Guillén، Sánchez، & Rodríguez ‐ Sanoja، 2010؛ Levy & Shoseyov، 2002). علاوه بر بسترهای طبیعی ، چسبندگی CBM به پلیمرهای مصنوعی ، به عنوان مثال ، پلی اتیلن ترفتالات (PET) گزارش شده است (Ribitsch et al.، 2013؛ Zhang، Wang، Chen، and Wu، 2013). بعلاوه ، پپتیدهای تقویت کننده چسبندگی برای مواد بیشماری ، به عنوان مثال ، برای طلا (به عنوان مثال ، Midas: 2: TGTSVLIATPYV ؛ کیم و همکاران ، 2010 ؛ GBP1: MHGKTQATSGTIQS ؛ براون ، 1997 ، تاملر ، اورن ، Duman ، Venkatasubramanian ، و Sarikaya، 2006؛ AuBP1: WAGAKRLVLRRE؛ Hnilova et al.، 2008؛ AuBP2: WALRRSIRRQSY؛ Hnilova et al.، 2008؛ Cys ‐ BP: CKPKELPEKLPELKPK (Ahx ‐ Ahx ‐ Biotin) C ‐ N2، 2016) فولاد ضد زنگ (به عنوان مثال ، MS ‐ S1: ATIHDAFYSAPE؛ Zuo، nrnek، & Wood، 2005؛ MS ‐ S2: NLNPNTASAMHV؛ Zuo et al.، 2005؛ MTWDPSLASPRS؛ Vreuls et al.، 2010)، silicon (به عنوان مثال ، TBP ‐ 1) : RKLPDAPGMHTW؛ Sano، Sasaki، & Shiba، 2005؛ P2: LLADTTHHRPWT؛ Estephan et al.، 2011؛ ، 2014 ، PC4: SLVSHMQT ؛ Ramakrishnan و همکاران ، 2015) ، پلی استایرن (PS ؛ به عنوان مثال ، PB ‐ TUB: VHWDFRQWWQPS؛ Qiang et al.، 2017؛ PS ‐ 19: RAFIASRRIKRP؛ Kumada et al.، 2006؛ c02: YLTMPTP؛ Serizawa، Techawanitchai، & Matsuno، 2007؛ تاکیستاتین A2 (TA2): YSRCQLQGFNCVVRSYGLPTIPCCRGLTCRSYFPGSTYGRCQRY؛ Rübsam، Weber، Jakob، & Schwaneberg، 2018)، و پلی پروپیلن (PP؛ به عنوان مثال، TSDIKSRSPHHR، HTQNMRMYEPWF؛ Cunningham، Lowe، O'brien، Wang، & Wilkins، 2011؛ Cecropin A (CecA): KWKLFKKKYKVKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGXGGGGGGGGGGGGGGGGGGGXGGGGG، Böker، Jakob، & Schwaneberg، 2017؛ Chromatography مایع اوج I (LCI): AIKLVQSPNGNFAASFVLDGTKWIFKSKYYDSSKGYWVGIYEVWDRK؛ Rübsam و همکاران ، 2017).
در اینجا ، ما یک پلت فرم بیحرکتی جهانی را بر اساس پپتیدهای تقویت چسبندگی (برچسب های مهم) گزارش می کنیم. سه پپتید ترویج چسبندگی ، CecA ، LCI و TA2 به دلیل اتصال گزارش شده به پلیمرهای مصنوعی (PS ، PP ، PUR ، کوپلیمرهای ترابلاک مانند PIB1000 ‐ PEG6000 ‐ PIB1000 و PMOXA15 ‐ PDMS68 ‐ PMOXA15 ؛ اسلام ، آپیتیوس ، Jakob ، و شووانبرگ ، 2019؛ کلرموند ، Poschenrieder ، و Castiglione ، 2016؛ نور و همکاران ، 2012؛ Rübsam و همکاران ، 2017؛ Rübsam، Weber et al.، 2018؛ Rübsam، Davari، Jakob، & Schwaneberg، 2018)، and طبیعی به عنوان مثال ، برگ های گیاهان (Meurer et al.، 2017؛
schwinges و همکاران ، 2019). پلت فرم بیحرکتی توسعه یافته امکان پوشش طیف گسترده ای از مواد صنعتی و پزشکی را دارد. شش ماده انتخاب شدند: طلا به دلیل خاصیت نوری ، حرارتی و الکترونیکی برای کاربردهای پزشکی و بیوتکنولوژی (به عنوان مثال در حسگرهای زیستی) مورد استفاده قرار می گیرد (همائی و همکاران ، 2013). به عنوان مثال ، PET به دلیل غیر ایمنی بودن در دستگاه های تماس با خون مورد استفاده قرار می گیرد (Ramachandran ، Chakraborty، Kannan، Dixit، & Muthuvijayan، 2019). فولاد ضد زنگ معمولاً در نواحی ارتوپدی مورد استفاده قرار می گیرد و مزیت مقاومت در برابر خوردگی را بهمراه سازگاری زیست سازگار به همراه دارد (محد داود ، حسین العشووال ، عبدالکدیر ، و سعیدین ، 2018)؛ PS و PP پلیمرهای مصنوعی هستند که به عنوان مثال به عنوان حامل آنزیم مورد استفاده قرار می گیرند (Jesionowski et al.، 2014)؛ به عنوان مثال ، مواد مبتنی بر سیلیکون ، متداول ترین مواد نیمه هادی در میکروالکترونیک و نانوالکترونیک هستند و به عنوان مثال ، در بیوسنسینگ کاربرد دارند (Estephan et al.، 2011؛ Ji، Wang، Song، Chu، and He، 2018).
برای نشان دادن کاربرد عمومی پلتفرم توسعه یافته ، برچسب های Matter to به دو آنزیم مربوط به صنعت ، فیتاز (YmPh ، Yersinia mollaretii ، 47 kDa؛ Shivange & Schwaneberg، 2017؛ Shivange et al، 2012) و سلولز (CelA2، کتابخانه metagenome ، 69 کیلو دالتون ؛ ایلبرگر و همکاران ، 2012). فیتازها (میو ‐ اینوزیتول هگزاکیسفسفات فسفوهیدرولاز) کاتالیز حذف متوالی فسفات معدنی از اسید فیتیک با هیدرولیز. فیتازها دارای ارزش بازار تقریباً 350 میلیون دلار در سال هستند که بیش از 60٪ کل بازار آنزیم خوراک را نشان می دهد (Shivange & Schwaneberg، 2017). سلولزها دپلیمر شدن سلولز را کاتالیز می کنند و کاربردهای صنعتی را در آن می یابند ، به عنوان مثال ، تولید بیوتانول ، نساجی ، خمیر و کاغذ ، مواد غذایی و لباسشویی (Kuhad، Gupta، & Singh، 2011). علاوه بر این دو آنزیم انتخابی ، پروتئین فلورسنت سبز تقویت شده (eGFP) به برچسب های Matter ترکیب شد. فعل و انفعالات درون مولکولی بین آنزیم و برچسب Matter by توسط مارپیچ سفت (17 اسید آمینه ، AEAAAKEAAAKEAAAAAAA ، Ueda ، Kitayama ، Kamiya ، & Nagamune، 2001) جلوگیری می شود که به حداقل رساندن یا جلوگیری از تعامل آنزیمهای بی حرکت با سطح ماده نیز کمک می کند.
ما اتصال سه برچسب Matter را به شش ماده منتخب با تجسم مستقیم پروتئین های فیوژن eGFP ‐ Matter ‐ متصل به میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال بررسی کردیم. کاربرد عمومی سکوی Matter ‐ tag sub متعاقباً با دو آنزیم انتخاب شده بر اساس سیستم های تعیین کننده فعالیت فلوروژن استاندارد در شش ماده انتخاب شده نشان داده شد. اتصال YmPh ‐ LCI بیشتر با رزونانس پلاسمون سطح (SPR) طیف سنجی با محاسبه سطح جدایی ثابت و حداکثر سطح مشخص شد.
مواد و روش ها ی آنزیم تگ پلیمراز
تمام مواد شیمیایی مورد استفاده از AppliChem GmbH (Darmstadt، آلمان) ، Carl Roth GmbH (کارلسروهه ، آلمان) و Sigma ‐ Aldrich Chemie GmbH (اشتاینهایم ، آلمان) با درجه خلوص درجه معرف تحلیلی یا بالاتر خریداری شد. ژنهای مصنوعی از GeneArt AG (Regensburg، آلمان) به دست آمد ، الیگونوکلئوتیدها از Eurofins Science SE (Ebersberg، آلمان) به صورت نمکی و آنزیم ها از Biolabs New England (Frankfurt am Main، آلمان) خریداری شد. کیت های واکنش زنجیره ای پلیمراز و کیتهای استخراج پلاسمید از Qiagen GmbH (هیلدن ، آلمان) و Macherey ‐ Nagel GmbH & Co. KG (دورن ، آلمان) خریداری شد. صفحات ریزگردهای چاه PP و PS 96 ((MTPs) از Greiner Bio ‐ One GmbH (Frickenhausen ، آلمان) ، 24 بشقاب multiwell از Corning GmbH (Kaiserslautern ، آلمان) ، 25 بشقاب پتری مربع خوب از Thermo Fisher Scientific (Darmstadt، آلمان) خریداری شد. و 96 صفحه چاه عمیق از VWR International (Darmstadt، آلمان). ویفرهای طلا از Sigma ‐ Aldrich Chemie GmbH (اشتاینهایم ، آلمان) ، ویفر سیلیکون (نوع P)) از Plano GmbH (وتزلار ، آلمان) ، فویل فولاد ضد زنگ (X6CrNiTi18‐10) از آرنولد شرودر Industrieöfen GmbH (Flörsheim am Main ، خریداری شد). آلمان) ، فویل PET (ES301445) از Goodfellow Cambridge Ltd. (هانتینگتون ، انگلیس) و صفحات PP از S ‐ Polytec GmbH (گوچ ، آلمان). تمام مواد با اتانول (درجه اتانول مطلق ، درجه تحلیلی) پس از تیمار با ddH2O تمیز و قبل از آزمایش با جریان نیتروژن خشک شدند. تراشه های حسگر SPR با روکش طلا از Cenibra GmbH (برامشه ، آلمان) خریداری شد.
2.1 پلاسمیدها و سویه ها آنزیم تگ پلیمراز
پلاسمید pET28a (+) (Novagen ، Darmstadt، آلمان) به عنوان بردار بیان برای سازه های همجوشی eGFP‐ و سلولز used استفاده شد. پلاسمید pALXtreme b 5b (Shivange و همکاران ، 2012) برای بیان سازه های فیوژن فیتاز استفاده شد. سویه اشرشیا کولی DH5α به عنوان کرنش کلونینگ استفاده شد. برای بیان eGFP‐ و سازه های فیوژن سلولز از E. coli BL21 ‐ Gold (DE3) استفاده شد. بیان سازه های فیتاز فیوژن با استفاده از سلول های E. coli BL21 ‐ Gold (DE3) LacIQ1 (Blanusa ، Schenk ، صادقی ، Marienhagen و Schwaneberg ، 2010 ؛ Shivange و همکاران ، 2012) انجام شد.
2.2 کلونینگ سازه های فیوژن Matter ‐ tag ‐ آنزیم تگ پلیمراز
سازه های فیوژن N‐ و C ‐ terminal Matter ‐ با استفاده از PLICing (لیگاز مبتنی بر فسفوروتیوات - کلونینگ ژن مستقل ؛ Blanusa و همکاران ، 2010) تولید شدند. سه پپتید مختلف ، CecA ، LCI و TA2 به عنوان برچسب های مهم (جدول 1) مورد بررسی قرار گرفت. پروتئینهای فیوژن N ‐ Matter ‐ ایجاد شده از تگ N ‐ ترمینال Matter separated که توسط یک مارپیچ 17 اسید آمینه سفت جدا شده است (17H ، AEAAAKEAAAKEAAAKA ؛ آری و همکاران ، 2001) از C ‐ ترمینال eGFP یا آنزیم. از سوی دیگر ، پروتئینهای فیوژن C ‐ Matter ‐ tag of از E F ترمینال EGFP یا آنزیم N ‐ متمایز شده توسط محل سخت ویروس 17H و ویروس اچ توتون (TEV) جدا شده است (ENLYFQG؛ Kapust و همکاران ، 2001) از C ‐ ترمینال برچسب ها (شکل S1 را ببینید).
2.3 سازه های همجوشی eGFP ‐ Matter ‐ tag
eGFP به عنوان پروتئین گزارشگر به برچسب های Matter f ترکیب شد تا اثبات بصری مستقیم از اتصال به شش ماده انتخاب شده داشته باشد. N usion ماده N برچسب construc سازه های فیوژن pET28a :: CecA / LCI / TA2–17H ‐ eGFP و C ‐ Matter ‐ برچسب ‐ سازه های فیوژن pET28a :: eGFP ‐ 17H ‐ TEV ‐ CecA / LCI / TA2 مطابق گزارش های قبلی تولید شد Rübsam et al.، 2017؛ Rübsam، Weber et al.، 2018). استراتژی کلونینگ دقیق در پشتیبانی از مواد اطلاعاتی شرح شده است. آغازگرها در جدول S1 نشان داده شده است.
2.4 سازه های فیوژن فیتاز و سلولز ase ماده ‐ برچسب آنزیم تگ پلیمراز
ژن Yersinia mollaretii ATCC 43969 phytase (appA) (GenBank: JF911533.1) کد آنزیم فیتاز YmPh را که دارای وزن مولکولی 47 کیلو دالتون است ، کد می کند (Shivange و همکاران ، 2012). ژن celA2 (GenBank: JF826524.1) برای آنزیم سلولز CelA2 با وزن مولکولی 69 کیلو دالتون کدنواش کد می کند (ایلبرگر و همکاران ، 2012). نوع سلولز CelA2M2 (H288F) در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفت (لمان و همکاران ، 2012). برچسب های Matter C CecA ، LCI و TA2 درون ستون فقرات pALXtreme ‐ 5b :: YmPh ستون فقرات یا pET28a :: ستون فقرات CelA2M2 با استفاده از روش PLICing کلون شدند (بلانوسا و همکاران ، 2010). بدین ترتیب ، pET28a :: eGFP ‐ 17H ‐ TEV ‐ Matter ‐ به عنوان الگوی درج برای سازه های فیوز C ‐ Matter و برچسب ET سازه های فیوژن و pET28a :: Matter ‐ tag ‐ 17H ‐ eGFP به عنوان الگوی درج برای برچسب N ‐ Matter served سازه های فیوژن (شکل S1 و جدول S2). پروتئین های تلفیقی حاصل با اختصارات مربوطه در جدول 2 نشان داده شده است. استراتژی کلونینگ تفصیلی سازه های تولید شده در اطلاعات پشتیبان گزارش شده است (جداول S3 و S4).
2.5 بیان ساختارهای همجوشی eGFP ‐ Matter ‐
تولید پروتئین در تکان دادن بطری سازه های همجوشی eGFP ‐ Matter ‐ همانطور که قبلاً گزارش شده بود انجام شد (Rübsam و همکاران ، 2017). گلوله های سلول در دمای 20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
2.6 بیان سلولهای سازنده سلولز ‐ ماده ‐ برچسب
برای آماده سازی پیش دبستانی ، 4 میلی لیتر LB (رسانه (10 گرم در لیتر تریپتون ، 10 گرم در لیتر سدیم کلسیم ، 5 گرم در لیتر عصاره مخمر و 50 میکروگرم در میلی لیتر کانامیایسین) با گلاب کشت مربوطه تلقیح و انکوبه شد (16 ساعت ، 37 درجه C ؛ 210 دور در دقیقه ، Multitron Pro ؛ Infors AG ، Bottmingen ، سوئیس) در لوله های شیشه ای. کشتهای اصلی حاوی 100 میلی لیتر TB ‐ رسانه (عصاره مخمر 24 گرم در لیتر ، 12 گرم در لیپ پپتون ، 4 میلی لیتر در لیتر گلیسرول ، 12/54 گرم در لیتر K2HPO4 ، 2/31 گرم در لیتر KH2PO4 ، و 50 میکروگرم در میلی لیتر کانامایسین) با تلقیح شدند 1 میلی لیتر قبل و انکوباتور (37 درجه سانتی گراد ، 2 ساعت ؛ 210 دور در دقیقه ، Multitron Pro ؛ Infors AG). بیان بیش از حد پروتئین با افزودن ایزوپروپیل β ‐ D ‐ 1 ‐ تیوگالاکتوپرانوزید (IPTG ؛ غلظت نهایی 0.1 میلی متر میلی متر) و کاهش دمای کشت تا 30 درجه سانتیگراد (جوجه کشی: 4 ساعت ؛ 210 دور در دقیقه ، مولتی ترون Pro). سلولها توسط سانتریفیوژ (3،200 گرم ، 20 دقیقه ؛ 4 درجه سانتیگراد ، Eppendorf سانتریفیوژ 5810R ؛ Eppendorf AG ، هامبورگ ، آلمان) جمع آوری و گلوله ها در دمای 20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
2.7 بیان ساختارهای فیوژن فیتاز ‐ ماده ‐
نمونه ها با گلبول های مربوطه (10 میلی لیتر LB ‐ در لوله های شیشه ای ، 10 گرم در لیترپترون ، 10 گرم در لیتر سدیم کلسیم ، 5 گرم در لیتر عصاره مخمر و 100 میکروگرم در میلی لیتر آمپی سیلین) تلقیح و انکوباسیون شدند (8 ساعت ، 37 درجه سانتیگراد ؛ 210 دور در دقیقه ، Multitron Pro). کشت اصلی (200 میلی لیتر ZYM ‐ 5052 خودکار القاء خودکار در فلاسک ارلنمایر [1 L] ، 100 میکروگرم بر میلی لیتر آمپی سیلین ؛ Studier ، 2005) با پیش دانه مربوطه (2 میلی لیتر) تلقیح شد و انکوبه شد (16 ساعت ، 37 درجه سانتیگراد) ؛ 210 دور در دقیقه ، Multitron Pro). سلول ها توسط سانتریفیوژ (3،200 گرم ، 20 دقیقه ، 4 درجه سانتیگراد ؛ Eppendorf سانتریفیوژ 5810R) جمع آوری شد و گلوله ها در دمای 20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
2.8 تصفیه و نمک زدایی فیتاز و فیتاز ‐ LCI
YmPh و YmPh ‐ LCI با استفاده از کروماتوگرافی تبادل کاتیون ((عملکرد بالا HiTrap® SP ؛ GE بهداشت ، اوپسالا ، سوئد ؛ ÄKTAprime به علاوه ، GE بهداشت و درمان) خالص شدند و پس از آن مطابق پروتکل منتشرشده ، نمک زدایی و تمرکز یافتند (Körfer et al.، 2018؛ Shivange و همکاران ، 2012). پروتئین های خالص در 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. غلظت پروتئین با اندازه گیری میزان جذب اشعه ماوراء بنفش در غلظت 280 نانومتر با طیف سنجی (نانودروپ ™ 2000 ؛ ترمو فیشر علمی) با استفاده از ضرایب انقراض (M-1 · cm-1) و توده های مولکولی (کیلو دالتون) پروتئین های خالص تعیین شد (YmPh: 47.3 کیلو دالتون ، 49890 M − 1 · cm − 1؛ YmPh ‐ LCI: 55.2 kDa ، 73840 M − 1 · cm-1). ضرایب انقراض و توده های مولکولی با ابزار ProtParam (https://web.expasy.org/protparam) محاسبه شد. میزان خلوص پروتئین با استفاده از نرم افزار ImageJ 1.48v بررسی شد ، و شدت باند های الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید سدیم دودسیل سولفات سدیم دودسیل سولفات سدیم دودسیل سولفات سدیم دودسیلیل سولفات سدیم دودسیلیل سولفات سدیم دودسیلیل سولفات سدیم دودسیلیل سولفات سدیم دودسیلیل سولفات سدیم دودسیلیل سولفات سدیم دودسیلیل سولفاته مورد بررسی قرار گرفت. فعالیت آنزیمهای خالص همانطور که در پشتیبانی از مواد اطلاعاتی شرح داده شد ، تعیین شد. از آنزیمهای خالص برای طیف سنجی SPR استفاده شد.
تجزیه و تحلیل بیحرکتی پروتئین های همجوشی eGFP ‐ Matter by توسط میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال
گلوله های سلول منجمد در بافر تریس / هیدروکلراید (50 میلی متر ، pH 8.0 ؛ 6 میلی لیتر بافر در گلوله سلول 1 گرم) به حالت تعلیق درآمد. لیز سلولی با سونوگرافی (3 دقیقه ، پالس 15/15 ، دامنه 60 درصد ؛ پردازنده اولتراسونیک VCX 130 ، Sonics & Material Inc. ، نیوتن ، CT) و سانتریفیوژ انجام شد (21130 گرم ، 15 دقیقه ، 4 درجه سانتیگراد ؛ Eppendorf Centrifuge 5424R ) پروتئین محلول را از پروتئین های نامحلول و قطعات سلول جدا کنید. مواد مورد بررسی (PP ، PS ، PET ، استنلس استیل ، طلا و ویفر سیلیکون) برش داده شدند (1 cm 1 سانتی متر) و با پروتئین های همجوشی eGFP ‐ Matter ‐ Tag (پوشش داده شده با پروتئین فیوژن eGFP ated Matter ated پوشش داده شدند). به عنوان کنترل ، رویی حاوی eGFP ‐ 17H ‐ TEV بدون ماده ‐ برچسب بررسی شد. طبق کار قبلی ، از آنزیم ها و پروتئین های هدف به مقدار زیاد استفاده شده است (Rübsam و همکاران ، 2017). سوپرناتانت برداشته شد ، مواد با 10 میلی لیتر بافر تریس / هیدروکلراید (50 میلی متر ، pH 8.0) شسته شدند و به ظرف های پتری مربع 25 چاه که پر شده از 2 میلی لیتر بافر Tris / HCl (50 میلی متر ، pH 8.0) منتقل شدند. نمونه ها جوجه کشی شدند (2 دقیقه) ، بافر برداشته شد ، و بافر جدید (سه بار) اضافه شد. نمونه ها برداشته شدند ، با 10 میلی لیتر ddH20 شسته شدند و با جریان نیتروژن خشک شدند. اتصال پروتئین های همجوشی eGFP ‐ Matter ‐ با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال (TCS SP8 ؛ Leica Microsystems CMS GmbH ، مانهایم ، آلمان) تعیین شد. نمونه ها با 488 نانومتر ، 10 درصد شدت لیزر هیجان زده شدند. ردیابی با یک آشکارساز PMT2 انجام شد (انتشار 500-565 نانومتر ، افزایش برای هر ماده متفاوت بود ؛ به جدول S5 مراجعه کنید).
2.10 تهیه و اتصال پروتئین های فیوژن آنزیم ‐ Matter ‐ برچسب ها به مواد منتخب
گلوله های سلول منجمد در بافر مربوطه متوقف شدند (فیوزهای YmPh: 50 میلی متر بافر تریس / هیدروکلراید ، pH 7.4 ؛ فیوزهای CelA2M2:: بافر 0.2 M KPi ، pH 7.2 ؛ بافر 6 میلی لیتر در 1 گرم گلوله سلول). سلولها با سونوگرافی (3 دقیقه ، پالس 15/15 ، دامنه 60٪ ؛ پردازنده اولتراسونیک VCX 130 ، Sonics & Material Inc.) ، سانتریفیوژ شدند (21130 گرم ؛ 15
دقیقه ، 4 درجه سانتیگراد؛ Eppendorf سانتریفیوژ 5424R) ، و تجزیه و تحلیل SDS-PAGE انجام شد. فعالیت آنزیمی در مایع رویی مشخص شد و به کمترین فعالیت شناسایی شده نرمال شد. سنجش فعالیت آنزیمهای بی حرکت روی بسترها به شرح زیر انجام شد: بیحرکتی آنزیم روی PS و PP در MTP های سیاه انجام شد. سوپرناتانتهای نرمال شده فعالیت به درون چاهها (100 میکرولیتر از لیتر در هر چاه) پر شده و انکوبه شدند (15 دقیقه ، 600 دور در دقیقه ، RT ؛ شاکر MTP TiMix5 ، ادموند بولر GmbH ، بدلشوزن ، آلمان). پس از برداشتن مایع رویی ، سه مرحله شستشو با 200 میکرولیتر بافر انجام شد. ، شاکر MTP TiMix 5 ؛ ادموند بالر GmbH). پس از آن ، فعالیت با اضافه کردن بستر مربوطه مشخص شد. فعالیت آنزیمی به واحدها تبدیل شد ، به موجب آن یک واحد (U) آنزیم به عنوان مقدار آنزیم تعریف شده که تبدیل 1 میکرومولار بستر را کاتالیز می کند (YmPh: 4 ‐ MUP ؛ CelA2M2: 4 ‐ MUC) در هر دقیقه. میانگین فعالیت (U) از میانگین مقادیر شش تکرار محاسبه شد.
بیحرکتی آنزیم بر روی PET و فولاد ضد زنگ روی تکه هایی که از مواد مربوطه مهر می شوند (قطر 5 میلی متر) انجام شد و هر لکه به یک چاه از MTP 24 چاه منتقل شد. هر پچ با 400 میکرولیتر لیتر رویه (15 دقیقه ، 400 دور در دقیقه ؛ RT ، MTP شاکر TiMix 5 ؛ ادموند بولر GmbH) پوشانده شد. مایع برداشته شد و هر پچ سه بار با بافر (1 میلی لیتر ؛ 400 دور در دقیقه ، 2 دقیقه ؛ RT ، MTP شاکر TiMix 5) شسته شد. تکه ها به MTP جدید چاه عمیق 96 جدید منتقل شده و محلول بستر 300 میکرولیتر اضافه شد. میانگین فعالیت (U) از میانگین مقادیر چهار تکرار محاسبه شد.
بیحرکتی آنزیم روی طلا و سیلیکون بر روی ویفرهایی که به مربع 5 5 میلی متر بریده شده اند و با 20 میکرو لیتر رویی در قسمت بالای آن پوشانده شده است ، انجام شد. سوپرناتانت برداشته شد ، مربعها با 1 میلی لیتر بافر شستشو داده شدند و هر مربع به یک چاه از MTP چاه 24 درجه منتقل شد. تکه ها سه بار با بافر (1 میلی لیتر ، 400 دور در دقیقه ؛ 2 دقیقه ، RT ؛ شاکر MTP TiMix 5) شسته شده و به یک MTP چاه عمیق 96 جدید منتقل شدند. واکنش با اضافه کردن 300 میکرولیتر از محلول بستر مربوطه آغاز شد. میانگین فعالیت (U) از میانگین مقادیر چهار تکرار محاسبه شد.
2.11 تعیین فعالیت پروتئین های سلولاز و سلولاز ‐ ماده ‐ برچسب ‐ در محلول و پس از اتصال ماده (آزمایش MUC 4)
فعالیت پروتئین های همجوشی CelA2M2 و CelA2M2 ‐ Matter ‐ با استفاده از روش سلوبیوکسید 4 ‐ methumbumbiferyl ‐ β ‐ D ((4 ‐ MUC) تعیین شد (Lehmann و همکاران ، 2012). آنزیم CelA2M2 بستر 4 ‐ MUC را هیدرولیز می کند و منجر به سلولیوزید و فلوئوروفور 4 ‐ methylumbelliferone (4 ‐ MU) می شود ، که با دستگاه خواننده صفحه میکروتیتر Tecan Infinite® M1000 PRO شناسایی می شود (گروه Tecan Ltd.، Mednnedorf، Switzerland). محلول سهام MUC 4 ‐ mM 4 UC در ddH2O تهیه شد. به عنوان راه حل کار ، سهام با ddH2O به غلظت 0.05 میلی متر رقیق شد.
پس از لیز سلولی ، فعالیت آنزیم در محلول تشخیص داده شد. این مایع رویی 400 بار بافر (بافر 0.2 میلی لیتر KPi ، pH 7.2) رقیق شد ، 20 میکرولیتر به یک MTP PS سیاه منتقل شد ، و 20 میکرولیتر KPi بافر (0.2 M ، pH ، 7.2) اضافه شد. واکنش با افزودن 20 میکرولیتر 0.05 میلی متر 4 ‐ MUC آغاز شد و تبدیل به محصول 4 ‐ MU مورد بررسی قرار گرفت (Tecan Infinite® M1000 PRO ، فاصله: 1 دقیقه ، زمان: 15 دقیقه ، λکس: 330 نانومتر ، لیم: 450 nm ، به دست آورد: 140 ، RT). فعالیت پروتئین های همجوشی CelA2M2 و CelA2M2 ‐ Tag-Mat ‐ به کمترین فعالیت انجام شد.
برای تشخیص فعالیت پروتئینهای فیوژن CelA2M2 ‐ Matter ‐ Tag after پس از اتصال به PS و PP ، 20 میکرولیتر از 05/0 میلی متر 4 ‐ MUC با 40 میکرولیتر بافر KPi (0.2 M ، pH ، 7.2) مخلوط شدند و بر روی چاههای خشک روکش دار اضافه شدند. واکنش. فعالیت مورد بررسی قرار گرفت (Tecan Infinite® M1000 PRO ، فاصله: 1 دقیقه ، زمان: 20 دقیقه ، λex: 330 نانومتر ، لیم: 450 نانومتر ، سود: 140 ، RT). برای تعیین فعالیت بر روی بسترهای پوشش داده شده PET ، فولاد ضد زنگ ، طلا و ویفر سیلیکون ، محلول MUC 4 µ 300 میکرولیتر به MUC به هر نمونه اضافه شد (100 میکرولیتر 0.05 میلی متر 4 ‐ MUC ، 200 میکرولیتر بافر KPi [0.2 M ، pH 7.2] ) محلول واکنش (25 میکرولیتر) به MTPs PS سیاه منتقل شد ، با 25 میکرولیتر KPi بافر (0.2 M ، pH 7.2) رقیق شد و فلورسانس ثبت شد (Tecan Infinite® M1000 PRO ، فاصله: 30 دقیقه ، زمان: 180 دقیقه ، λکس: 330 نانومتر ، لیم: 450 نانومتر ، افزایش: 140 ، RT).
2.12 تعیین فعالیت پروتئین های فیوز و فیتاز ‐ ماده برچسب in در محلول و بعد از اتصال مواد (آزمایش MUP 4)
فعالیت پروتئین های همجوشی YmPh و YmPh ‐ Matter با روش 4 ‐ methylumbelliferyl ‐ β ‐ D ‐ فسفات (4 ‐ MUP) سنجش (Shivange و همکاران ، 2012) تعیین شد. Phytases هیدرولیز 4 UP MUP به محصول فلورسنت 4 MU. بستر 4 ‐ MUP به عنوان محلول سهام 10 میلی متر در 250 میلی متر بافر استات سدیم (250 میلی متر استات سدیم ، pH 5/5 ، 1 میلی متر CaCl2 ، 0.01 T بین 20 prepared) تهیه شده است. در سنجش فعالیت ، محلول سهام به 1 میلی متر 4 ‐ MUP با بافر استات سدیم (250 میلی متر استات سدیم ، pH 5/5 ، 1 میلی متر CaCl2 ، 0.01 T بین 20 dil رقیق می شود).
لیزات سلول 400 بار برای تعیین فعالیت پروتئین های همجوشی YmPh و YmPh-Matter رقیق شد. سپس ، 60 میکرولیتر مایع رویی رقیق شده با 140 میکرولیتر بافر سدیم استات مخلوط شد. لیز سلول رقیق شده (25 میکرولیتر) به MTP های PS 96 ‐ چاه سیاه منتقل شد. واکنش با اضافه کردن محلول 4 ‐ MUP (25 میکرولیتر ، غلظت نهایی 1 میلی متر ، 250 میلی مولار استات سدیم ، pH 5/5 ؛ 1 میلی مولار CaCl2 ، 01/0 درصد بین 20 started) آغاز شد. فعالیت سازه های فیتاز در محلول با اندازه گیری افزایش در فلورسانس نسبی در طول زمان با استفاده از یک دستگاه خواننده صفحه میکروتیتر Tecan Infinite® M1000 PRO (فاصله زمانی: 1 دقیقه ، زمان: 15 دقیقه ، λکس: 360 نانومتر ، لیم: 465 نانومتر) تعیین شد. افزایش: 140 ، RT).
برای تشخیص فعالیت سازه های همجوشی YmPh ‐ Matter on محدود بر روی PS و PP ، 50 میکرولیتر از محلول MUP 1 میلی متر 4 MUP به چاههای خشک اضافه شد. این فعالیت با استفاده از Tecan Infinite® M1000 PRO صفحه ریز ریز ریز ریزگردها (افزایش: 140 ؛ فاصله: 1 دقیقه ، زمان: 20 دقیقه ، درجه حرارت: RT ، معادل: 360 نانومتر ، لیم: 465 نانومتر) بررسی شد. برای تعیین فعالیت بر روی بسترهای PET ، استیل ضد زنگ ، طلا و ویفر سیلیکون ، واکنش با افزودن 300 میکرولیتر 4 ‐ MUP به هر نمونه (1 میلی متر ، 250 میلی متر استات سدیم ، pH 5/5 ، 1 میلی متر CaCl2 ، 0.01) آغاز شد. ٪ Tween 20). محلول واکنش (25 میکرولیتر) به MTPs PS سیاه منتقل و با بافر سدیم استات رقیق شد (25 میکرولیتر ، 250 میلی متر استات سدیم سدیم ؛ pH 5.5 ، 1 میلی متر CaCl2 ؛ 0.01 0.01 بین 20). فعالیت با استفاده از Tecan Infinite® M1000 PRO مورد بررسی قرار گرفت (فاصله: 30 دقیقه ، زمان: 150 دقیقه ، قطعه: 330 نانومتر ، لیم: 450 نانومتر ، سود: 140 ، RT).
استفاده مجدد از فیتاز ‐ LCI در PS و PP
قابلیت استفاده مجدد YmPh-LCI در PS و PP مورد بررسی قرار گرفت. بنابراین ، MTP های PS و PP همانطور که قبلاً با سوپرناتانت حاوی YmPh I LCI شرح داده شد ، پوشانده شدند (به بخش 2.10 مراجعه کنید). پس از آن ، MTP ها سه بار با 200 میکرولیتر بافر سدیم استات شستشو داده شدند (250 میلی مولار استات سدیم ، pH 5/5 ، 1 میلی متر CaCl2 ، 0.01 T بین 20؛ ؛ 2 دقیقه ، 600 دور در دقیقه ؛ RT ، MTP شاکر TiMix 5) ، به دنبال نهایی مرحله جوجه کشی برای تقلید از شرایط سنجش (20 دقیقه ، 50 میکرولیتر بافر استات سدیم: 250 میلی متر استات سدیم ؛ pH 5/5 ، 1 میلی متر CaCl2 ؛ 0.01 0.01 بین 20). سنجش فعالیت مانند قبل برای توصیف فعالیت سازه های همجوشی محدود YmPh-Matter ‐ بر روی PS و PP انجام شد. پس از هر واکنش ، 200 میکرولیتر بافر سدیم استات در هر چاه اضافه شد. پس از آن ، مایع از آن خارج شد
هر چاه با لوله کشی ، به دنبال آن یک مرحله شستشوی اضافی با 200 میکرولیتر بافر سدیم استات (250 میلی متر استات سدیم ، pH 5/5 ؛ 1 میلی متر CaCl2 ، 0.01 T بین 20؛ ؛ 2 دقیقه ، 600 دور در دقیقه ؛ RT ، MTP شاکر TiMix 5). فعالیت باقیمانده پس از هر چرخه از میانگین مقادیر چهار تکرار در مقایسه با مقدار شروع محاسبه شد. قابلیت استفاده مجدد برای هشت چرخه تعیین شد.
2.14 ایزوترم لانگمیر و تعیین پوشش ثابت و سطح پوشش
سینتیک جذب YmPh ‐ LCI روی طلا با استفاده از طیف سنجی SPR در غلظت محلول پپتید از 2.5 تا 3000 نانومتر با استفاده از سیستم SPR MP ‐ SPR Navi ™ 210A VASA MP-MPR (BioNavis Ltd ، تامپره ، فنلاند) در 670 نانومتر انجام شد. محلول YmPh ‐ LCI در بافر تریس / هیدروکلراید (50 میلی متر ، pH 7.4) بر روی تراشه SPR طلا در حالی که موقعیت پلاسمون ها ثبت شد ، پرواز شد. پس از جذب به فلات ، بافر Tris / HCl (50 میلی متر ، pH 7/4) معرفی شد. مقدار جاذب YmPh ‐ LCI از پاسخ سنسور در μRIU استخراج شد و به عنوان تفاوت بین پایه در بافر قبل و بعد از تزریق پروتئین (ΔμRIU) محاسبه شد و در ng / cm2 به پوشش سطح (Q) تبدیل شد (به معادله مراجعه کنید) S1)) با استفاده از SPR ‐ Navi Viewer Data (نسخه 6.4.0.7). برای مقایسه پوشش سطح YmPh-LCI با YmPh ، غلظت محلول پروتئین از 200 نانومتر بر روی تراشه SPR طلای پرواز شد.
فرآیند جذب YmPhy ‐ LCI با استفاده از مدل ایزوترم Langmuir (معادله 1) بر اساس فرض فرایند جذب به صورت پویا برگشت پذیر از املاح غیرفعال کننده اندازه گیری شد و کلیه سایتهای جذب از انرژی جذب برابر منجر به تشکیل لایه تک مولکولی (Latour ، 2015)
مقدار املاح موجود در سطح (Q؛ مول / مترمربع) با مقدار املاح متصل شده در اشباع سطح (Qmax ، مول / متر مربع) ضرب شده با غلظت محلول املاح (C ، مول / L) تقسیم شده توسط مقدار غلظت محلول املاح (C ، مول / L) و ثابت تعادل جذب معکوس ، (Keq؛ L / مول). KD ثابت تفکیک به عنوان غلظت محلول مربوط به 50٪ از حداکثر مقدار املاح متصل به اشباع سطح (Qmax) تعیین می شود. KD محاسبه می شود Keq − 1 (Latour ، 2015).
3 نتیجه گیری برای آنزیم تگ پلیمراز
بخش نتایج به سه بخش تقسیم شده است تا کاربرد جهانی سکوی Matter ‐ tag for برای بیحرکتی آنزیم روی شش ماده منتخب (PS ، PP ، PET ، فولاد ضد زنگ ، طلا و ویفر سیلیکون) نشان داده شود. در بخش اول ، اتصال سه برچسب Matter selected انتخاب شده به شش ماده انتخاب شده مورد بررسی قرار گرفت. بخش دوم بر بیحرکتی دو آنزیم مهم صنعتی (فیتاز و سلولز) تمرکز دارد تا کاربرد عمومی را ارزیابی کند. به عنوان مثال YmPh ‐ LCI ، قابلیت استفاده مجدد آنزیم بی حرکت تعیین می شود. در قسمت سوم ، جذب YmPh ‐ LCI تجزیه و تحلیل می شود و پوشش سطح YmPh ‐ LCI با YmPh بدون مروج چسبندگی روی یک سطح طلا با طیف سنجی SPR مقایسه می شود. مورد دوم پتانسیل پروموتورهای چسبندگی را برای بیحرکتی عملکردی در یک ماده نمونه کمیت می کند.3.1 اتصال برچسب Matter selected انتخاب شده به شش ماده انتخاب شده
اتصال پروتئین های همجوشی eGFP ‐ Matter ‐ با شش ماده انتخاب شده با میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال مشاهده شد (شکل 1). به عنوان کنترل منفی eGFP ‐ 17H ‐ TEV (بدون برچسب ماده) بر روی سطوح مورد بررسی ، برای تعیین اتصال غیر اختصاصی استفاده شد. به طور خلاصه ، کنترل منفی بعد از شستن هیچگونه فلورسانس روی هیچ ماده ای نشان داد (شکل 1). تمام شش پروتئین فیوژن eGFP ‐ Matter ‐ tag (ترمینال N‐ یا C)) فلورسانس سبز در تمام پلیمرهای مصنوعی مورد بررسی (PS، PP، PET) به نمایش گذاشتند. پروتئین های همجوشی LCI و TA2 قوی ترین اتصال بر روی فولاد ضد زنگ و طلا را نشان دادند. نتایج مشابهی در سطوح ویفر سیلیکونی بدست آمد که ترمینال C f LCI و TA2 ذوب شده قویترین اتصال را نشان داد.
تگ Matter bind به شش ماده مورد بررسی در پلی استایرن (PS) ، پلی پروپیلن (PP) ، پلی اتیلن ترفتالات (PET) ، فولاد ضد زنگ ، طلا و ویفر سیلیکون متصل می شود. اتصال پروتئین های eGFP ‐ Matter ‐ tag ‐ Fusion with با میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال مورد بررسی قرار گرفت (نوار سفید نمایانگر مقیاس 100 میکرومتر است) ، پروتئین های فیواتی ph Matter ‐ tag with با 4 ‐ methylumbelliferyl ‐ β ‐ D ‐ فسفات (4 ‐ MUP) ) سنجش فعالیت ، و پروتئین های همجوشی سلولز ‐ ماده ‐ برچسب with با روش فعالیت MUC 4. فعالیت های پروتئین آنزیم ‐ Matter ‐ tag ‐ Fusion into در رابطه با آنزیم نوع وحشی (WT) (بدون برچسب ماده) تنظیم شد ، تا محاسبه بهبود فعالیت باشد. فعالیت های فیتاز زیر حد مجاز حساسیت سنجش 4 ‐ MUP به عنوان n.d توصیف شده است. (قابل تشخیص نیست) مقادیر بهبودی بی نهایت (∞) هستند ، زیرا هیچ فعالیت WT (فیتاز) مشاهده نشده است [شکل رنگ را می توان در wileyonlinelibrary.com مشاهده کرد]
3.2 بیحرکتی آنزیم با استفاده از برچسب های Matter
فعالیت این دو آنزیم از نظر صنعتی ، YmPh و CelA2M2 ، پس از بیحرکتی از طریق برچسب های Matter on بر روی شش ماده انتخاب شده ، مشخص شد و با آنزیم های نوع وحشی (WT) مقایسه شد. بدین ترتیب ، فعالیتهای حاصل از پروتئین فیوژن آنزیم ‐ Matter ‐ برچسب مربوط به آنزیم WT بر روی ماده مربوطه برای تعیین بهبود فعالیت قرار گرفتند (شکل 1). بهبود فعالیت به عنوان شاخص عملکرد برای برچسب های Matter استفاده می شود.
3.3 فعالیت فیتاز روی مواد انتخاب شده
فعالیت YmPh پس از بیحرکتی در سطح هدف و استفاده از مراحل شستشوی بعدی با استفاده از روش 4 ‐ MUP تعیین شد (هیدرولیز بستر 4 ‐ MUP ، تشخیص محصول فلورسنت 4 ‐ MU ؛ Shivange و همکاران ، 2012). قابل مقایسه با نتایج پروتئینهای فیوژن eGFP ‐ Matter ‐ ، فعالیت پروتئین های فیوژن YmPh ‐ Matter ((ترمینال N‐ و C imm) در سطح هدف بی حرکت در سطح هدف در تمام پلیمرهای مصنوعی، PS ، PP و PET ترکیبات C ‐ ترمینال برچسب های Matter to منجر به افزایش فعالیت تا 7.9 برابر در PS ، 11.7 برابر در PP و 18.3 برابر PET شد. فیوژن ترمینال N Mat برچسب های Matter in منجر به فعالیت های بهبود یافته تا 3.4 برابر در PS ، PP و PET در مقایسه با WT YmPh شد. ترکیب N-ترکیب CecA در YmPh منجر به بهبود فعالیت متوسط در PP و عدم بهبود در PET شد. در فولاد ضد زنگ ، هیچ فعالیت قابل توجهی از WT YmPh تشخیص داده شد (زیر حد حساسیت روش 4 ‐ MUP). برچسب های C ‐ به طور پایانی ذوب شده به طور قابل توجهی فعالیت YmPh را پس از بیحرکتی (از 0 به 427.23 ± 22.50 · 10-3 U) افزایش داده است. در طلا افزایش متوسطی در فعالیت (1.6-2.8 برابر در مقایسه با WT YmPh) برای کلیه پروتئین های YmPh ‐ Matter ‐ برچسب ((ترمینال N و C ‐) در مقایسه با WT YmPh مشاهده شد. در ویفر سیلیکون افزایش قابل توجهی در فعالیت (4.6-6.5 برابر) تنها با YmPh-CecA و YmPh-LCI در مقایسه با WT YmPh مشاهده شد. به طور کلی ، فیوز برچسب C ‐ terminal Matter به YmPh در مقایسه با فیشهای N ‐ ترمینال Matter ‐ tag activity فعالیت بالاتر در کلیه مواد مورد بررسی نشان داد.
3.4 فعالیت سلولز بر روی مواد انتخابی
فعالیت CelA2M2 پس از بیحرکتی در سطح هدف و استفاده از مراحل شستشوی بعدی با استفاده از روش 4 ‐ MUC تعیین شد (هیدرولیز بستر 4 UC MUC ، تشخیص محصول فلورسنت 4 ‐ MU ؛ لمان و همکاران ، 2012). پوشش PS و PP منجر به فعالیت پس زمینه زیاد شد. در PET ، افزایش قابل توجهی در فعالیت (تا 3.7 برابر) با پروتئین های فیوژن Matter ‐ مشاهده شد. فیوژن ترمینال N-CecA و LCI به فعالیت قابل توجهی بهبود یافته در PET منجر نشده است. ترکیب C و N ‐ ترمینال برچسب های Matter to به CelA2M2 منجر به فعالیت های بهبود یافته تا 2.4 برابر نسبت به WT CelA2M2 در فولاد ضدزنگ شد. بر روی طلا ، تمام پروتئین های همجوشی CelA2M2 ‐ Matter ‐ منجر به افزایش فعالیت CelA2M2 (بین 1.6 و 3.3 برابر در مقایسه با WT CelA2M2) شد. بر روی ویفر سیلیکون ، فعالیتهای قابل توجهی افزایش یافته (تا 5.3 برابر) پروتئین های فیوژن ماده بی حرکت در مقایسه با WT CelA2M2 مشاهده شد.
استفاده مجدد از فیتاز ‐ LCI در مواد انتخابی PS و PP
عملکرد YmPh ‐ LCI پس از بی حرکتی و استفاده مکرر در PS (شکل 2a) و PP (شکل 2b) مورد بررسی قرار گرفت. پس از یک چرخه واکنش ، فعالیت باقیمانده به ترتیب در PS و PP به 81٪ و 80٪ کاهش یافت (شکل 2). پس از هشت چرخه متعاقباً انجام شده ، فعالیت فیتاز> نسبت به فعالیت اولیه آن 50٪> بود.
ایزوترم جذب و سینتیک YmPh ‐ LCI روی طلا 3.6
جذب YmPh ‐ LCI روی طلا توسط SPR در زمان واقعی بررسی شد. راه حل YmPh ‐ LCI در بافر تریس / هیدروکلراید (50 میلی متر ، pH 7.4) بر روی طلا در محدوده غلظت 2.5-3000 نانومتر نیترات تزریق شد ، در حالی که پلاسمون های سطح مورد بررسی قرار گرفتند. پس از گذشت 20 دقیقه از تماس ، افزایش بیشتر پروتئینهای جذب مشاهده نشد و این مقدار به عنوان جذب تعادل برای هر غلظت مورد مطالعه (جدول S6) در نظر گرفته شد. مقدار پروتئین جذب شده در تعادل با غلظت پپتیدها به صورت یکنواخت افزایش یافته است (شکل 3a). از جذب تعادل پروتئینها برای ساخت ایزوترمهای جذب استفاده شد (شکل 3b). ایزوترم را می توان در یک مدل لانگمویر قرار داد. این بدان معناست که مکانیسم اتصال بستگی به یک نوع فرآیند واحد ، اتصال پپتید و این دارد که تمام محل های اتصال در سطح بدون در نظر گرفتن درجه اشباع احتمال اتصال یکسان دارند. این امر بیشتر تأیید می کند که LCI تنها ماده اتصال دهنده است و نه آنزیم پروتئین فیوژن. از تناسب لانگمویر ، ما یک ثابت تعادل (Keq) و ثابت تفکیک (KD) به مبلغ 34 ± 7 · 10 − 3 نانومتر در مترمربع (1 ± 7/3 · 7/7 · 107 M-1) و 6 29 29 نانومتر (2.9 ±) بدست آورده ایم. به ترتیب 0.6 · 10-8 M). حداکثر پوشش سطح (Qmax) به 21 ng 504 نانوگرم در سانتی متر مربع (شکل 3b) تعیین شد. چنین مقدار می تواند برای هر غلظت بالاتر از 200 نانومتر بدست آید. قابل توجه است ، چنین مقادیر پروتئین جاذب نزدیک به یک لایه کامل پروتئین است و نشان دهنده درجه بسیار بالایی از عملکرد سطح با غلظت های بسیار کم قابل دستیابی است. به عنوان شاهد ، ما میزان جذب WT YmPh فاقد LCI را اندازه گیری کردیم. ما سینتیک جذب را در غلظت 200 نانومتر انجام دادیم ، مقداری که YmPh-LCI در حال حاضر به حداکثر رسیده است. جذب کل YmPh ‐ LCI برای 457 نانوگرم در سانتی متر مربع ، در حدود 2.6 more برابر بیشتر از همتای بدون برچسب ماده ((WT YmPh: 176 نانوگرم در سانتی متر مربع) برای همان غلظت (شکل 3C). این نشان می دهد که نیروی محرکه اصلی برای اتصال سطح ، پپتید LCI است. جالب توجه است که فعالیت YmPh ‐ LCI روی طلا در مقایسه با WT YmPh 2.8 برابر افزایش یافته است (شکل 1 ، بیحرکتی YmPh ‐ LCI روی طلا) ، که نشان می دهد که LCI باعث بیحرکتی جهت گرا می شود.
4. بحث
قادر به بی حرکت کردن آنزیم های جهانی به عنوان تک لایه متراکم در محلول های آبی در دمای محیط بر روی مواد مختلف ، بستر مهمی برای کاربردهای مختلف بیوتکنولوژیک (به عنوان مثال ، بیوسنسورها ، فرآیندهای بیوکاتالیستی یا پوشش های سطح پلیمرها یا محصولات پزشکی) است. پپتیدهای تقویت کننده چسبندگی می توانند چنین ویژگی های بیحرکتی را ارائه دهند (شکل 4). بیحرکتی شرقی به عنوان تک لایه تعریف شده بر روی PP قبلاً توسط گروه ما گزارش شده بود (Rübsam و همکاران ، 2017) و برای YmPh ‐ LCI روی طلا توسط ایزوترم لانگمویر ترسیم شده ، که به خوبی با داده های تجربی تأیید می شود ، تأیید می کرد.
شکل 1 نشان می دهد که سه برچسب Matter enable برای فعال کردن بی حرکتی کارآمد در طیف گسترده ای از مواد متشکل از پلیمرهای مصنوعی (PP ، PS ، PET) ، فلزات (فولاد ضد زنگ ، طلا) و مواد مبتنی بر سیلیکون (ویفر سیلیکون) کافی است. به عنوان یک روند کلی ، می توان مشاهده کرد که برچسب C ترمینال برچسب های Matter e به eGFP اتصالات بهتری نسبت به فیوزهای ترمینال N N هستند. مورد دوم توسط فیوژن ترمینال C of تمام برچسب های Matter the با YmPh تأیید شد (شکل 1 را ببینید). برچسب های Matter to به فیتاز و سلولز تأثیر معنی داری در تولید پروتئین نداشت (شکل های S2 و S4 را ببینید). فعالیتهای حجمی فیتاز / سلولز حاوی لیزهای عاری از سلول بسته به برچسب Matter used افزایش یافته و کاهش یافته است (شکل S3 را ببینید). با این حال ، فعالیت خاص خالص YmPh ‐ LCI (393 88 393 U / میلی گرم) با WT YmPh قابل مقایسه بود (626 95 9533 U / میلی گرم ؛ به مواد اطلاعاتی پشتیبانی مراجعه کنید).
ثابت و تفکیک (KD) YmPh constant LCI 2.9 · 10-8 M تعیین شد و قابل مقایسه با مقادیر KD گزارش شده از آنتی بادی های برچسب ضد ‐ His ((آنتی بادی 3D5: 3.4 · 10-7 M ، آنتی بادی PentaHis: 1.0 · 10 − 9 M؛ M ،ller، Arndt، Bauer، & Plückthun، 1998) و برچسب های polyhistidine Ni برای Ni2 + ‐NTA (رایگان 6His ‐ پپتید: 1.4 · 10-8 M؛ Knecht، Ricklin، Eberle، and Ernst، 2009). مقادیر KD را می توان با استفاده از روشهای تکامل جهت دار به عنوان مثال پروتکل PePevo (Rübsam ، وبر و همکاران ، 2018) در یک کمپین KnowVolution (Rübsam ، داوری و همکاران ، 2018) ترویج چسبندگی هر چه بیشتر برچسب های Matter reduced کاهش داد.
در مورد CelA2M2 ، یک فعالیت پس زمینه بالا روی مواد آبگریز (PP ، PS) مشاهده شد (شکل 1 را ببینید) ، که نشان دهنده جذب سلولز غیر اختصاصی قوی است و شناسایی روندهای کلی را دشوار می کند. اتصال غیر اختصاصی را می توان به حوزه اتصال کربوهیدرات (داده ها نشان داده نشده است؛ Ribitsch و همکاران ، 2013 ؛ وب و همکاران ، 2019) و به جذب آبگریزی غیر اختصاصی CelA2M2 به پلیمرهای PP و PS نسبت داد. فعالیت پس زمینه CelA2M2 در سطوح بیشتر آبگریز مانند PET ، فولاد ضد زنگ ، طلا و سیلیکون به طور قابل توجهی کاهش یافت.
فعالیت آنزیمی فیوزهای سلولز ‐ Matter ‐ tag در مقایسه با WT سلولز به طور معنی داری به 5/5/3 برابر افزایش یافت.
پروتئین های همجوشی LCI با eGFP و YmPh ثابت کردند که LCI یک چسبندگی جهانی است- ترویج اتصال پپتید در پلیمرهای مصنوعی (PP ، PS ، PET) ، فلزات (فولاد ضد زنگ ، طلا) و ویفر سیلیکون. استفاده مکرر از بی حرکت سازی YmPh ‐ LCI نشان داده شد. پروتئین فیوژن YmPh ‐ LCI بی حرکت در PS و PP می تواند حداقل 8 چرخه در حالی که حفظ> 50 of از فعالیت آنزیمی اولیه استفاده مجدد شود. نتایج مشابه برای eGFP ‐ LCI نشان داد که کاهش فعالیت / فلورسانس به احتمال زیاد از تفکیک پروتئین های همجوشی از تکیه گاه حاصل می شود (شکل S5 را ببینید). با این وجود ، ادغام برچسب های Matter to به آنزیم ها / پروتئین ها ممکن است باعث تداخلات درون مولکولی شود که باعث تغییر کارآیی بیحرکتی می شود. جالب اینجاست که LCI در مقایسه با CecA و TA2 دارای یک طیف اتصال مواد گسترده تر است. ساختار LCI به زیبایی از یک سطح آبگریز و قطبی تشکیل شده است ، که تعادل بسیار خوبی بین برهم کنش های آبگریز و قطبی را ممکن می کند (شکل 4a). بنابراین ، LCI یک مروج چسبندگی ایده آل برای برنامه های کاربردی در بیوکاتالیز (به عنوان مثال ، سیلیس) ، در سیستم های کروماتوگرافی / تصفیه (PS ، PP) ، بیوسنسورها (طلا) و مواد بیولوژیکی است که در ایمپلنت ها ، منسوجات یا به عنوان مواد بسته بندی (PET ، فولاد ضدزنگ) مورد استفاده قرار می گیرد. )
چگونه LCI با پلیمرهای PS ، PP و PET ارتباط برقرار می کند؟ LCI شامل چهار Tyr است و سرشار از اسیدهای آمینه آبگریز مانند Ile ، Val و Phe است. زنجیره های جانبی این اسیدهای آمینه بسیاری از فعل و انفعالات آبگریز را با PS ، PP و PET تشکیل می دهند (به عنوان مثال از طریق ساختار حلقه بنزن PS ، تعامل آبگریز با گروه CH2 در PP و هر دو تعامل پشته و پیوندهای H H با PET). . LCI دارای یک ساختار کشیده با حلقه های معطر Tyr و Phe به عنوان زنجیره های جانبی است ، نشان می دهد که π-π انباشت از طریق گروه های فنیل ممکن است نقش مهمی در اتصال به PS و PET بازی کند. حلقه پیرول در گروه Pro و isopropyl Val نیز ممکن است در این تعامل نقش داشته باشد. Trp ، Phe ، Pro و Val که در توالی LCI وجود دارند ، متداول ترین اسیدهای آمینه در توالی های اتصال دهنده PS هستند (آدی ، ماتاراگونون ، رایدر ، کارتر ، و کی ، 1995 ، شکارچی ، 1994 ؛ شکارچی و سندرز ، 1990 ؛ ناکانیشی) ، Sakiyama، & Immura، 2001؛ Yamaguchi، Isozaki، Nakamura، Takaya، & Watanabe، 2016).
چگونه LCI می تواند به ویفرهای سیلیکونی متصل شود؟ ویفرهای سیلیکون همیشه دارای لایه ای از 5-5 نانومتر از اکسید سیلیکون بومی هستند. مطالعات اخیر در مورد جذب پپتید بر روی سطوح سیلیس حاکی از اهمیت زنجیره های جانبی قطبی برای جذب است (Seker & Demir، 2011). LCI حاوی چندین اسید آمینه اساسی و اسیدی مانند Asp و Arg (سطح قطبی ، شکل 4a) است. این اسیدهای آمینه به همراه گلوتامین های دیگر ممکن است یونیزاسیون شده و در اتصال با جذب الکترواستاتیک عمل کنند. جدای از تعامل الکترواستاتیک ، اهمیت تأثیرات مختلف مانند تعامل π-π و آبگریز در
همچنین حفره های موجود در پپتیدهای اتصال دهنده به سیلیس گزارش شده است (Notman et al.، 2010؛ Oren et al.، 2007؛ Puddu & Perry، 2012). پس از اتصال به سطوح سیلیس ، چندین اثر متقابل الکترواستاتیک بین مانده با بار مثبت (لیس و ارگ) و سیلیس با بار منفی پیش بینی می شود.
چگونه LCI می تواند به فولاد ضدزنگ و طلا وصل شود؟ مطالعات در مورد جذب پپتیدها بر روی سطوح استیل ضدزنگ نشان می دهد که رفتار جذب یک پپتید را می توان تا حد زیادی الکترواستاتیک در نظر گرفت (امامورا ، کاوازاکی ، آوادزو ، ساکیاما ، و ناکانیشی ، 2003). Sarikaya ، Tamerler ، Jen، Schulten، and Baneyx (2003) همچنین گزارش داده اند که برای توالی های پپتید با اتصال طلا ، سهم اصلی در انرژی جذب از پس مانده های قطبی حاصل می شود. بنابراین ، سطح قطبی LCI (شکل 4a) ممکن است در تعامل با فولاد ضد زنگ و طلا باشد.
5 نتیجه گیری برای آنزیم تگ پلیمراز
در پایان ، سه برچسب Matter the می توانند پروتئین ها و آنزیم ها را روی سطوح مختلف (پلیمرهای مصنوعی: PS ، PP ، PET ، فلزات: استنلس استیل ، طلا و ویفر سیلیکون) بی حرکت کنند. مزایای استفاده از بستر برچسب Matter in در کاربرد یک مرحله ای ساده آن در دمای محیط در محلول آبی حاوی پروتئین فیوژن Matter ‐ است. جالب توجه است ، تک لایه های متراکم برای مواد مورد بررسی بدست می آیند و LCI به دلیل توزیع عالی تعاملهای آبگریز و آبگریز به عنوان یک اتصال دهنده جهانی اثبات می شود. دومی در تقابل با پپتیدهای کوچک (<8 اسیدهای آمینه) است که از طریق یک ساختار 3D تعریف شده از رشته های β achieved ، که قادر به "آزادانه" تنظیم آبگریزی و آبگریزی فوق و همچنین زیر رشته های β tune است. علاوه بر این ، خواص پپتیدهای تقویت کننده چسبندگی می تواند برای بهبود ، به عنوان مثال ، مقاومت اتصال یا مقاومت پروتئولیتیک آن با طراحی کارآمد تکامل / طراحی منطقی تنظیم شود. علاوه بر این ، پیوند بین تگ های Matter ‐ و آنزیم های ذوب شده می تواند از نظر طول و انعطاف پذیری آن برای بهبود بیشتر عملکرد آنزیم تغییر کند.
اعترافات
نویسندگان از وزارت آموزش و تحقیقات فدرال آلمان (BMBF؛ FKZ: 031B0104B) بخاطر حمایت مالی تشکر می کنند. این مطالعه با پشتیبانی تحلیلی از مرکز فناوری شیمیایی پلیمر CPT ، با حمایت اتحادیه اروپا و ایالت فدرال North Rhine ph Westphalia (کمک مالی EFRE 30 00 883 02) انجام شد.